放大AAV载体生产：克服基因治疗临床转化的障碍
本文节选自对CEVEC Pharmaceuticals CEO Nicole Faust的专访《Scaling AAV vector manufacture: overcoming roadblocks to the translation of gene therapies》。由于水平有限，详细内容，请参考原文。
问：当前AAV载体制造的局限性对基因疗法的临床转化有什么影响？您认为使用当前AAV生产方法的主要挑战是什么?
NF：AAV基因治疗制造的最大挑战之一源于这样一个事实，即制造AAV载体的方法是在大学里开发的，因为是他们“发明”了基因治疗。在这种情况下，研究人员只需要少量的AAV物料，而且需要很快得到，所以他们使用了手头现有的方法。而且，由于这些最初的治疗方法都是针对极罕见疾病的，所以患者也不需要大量的治疗物料。对于他们来说，开发可放大的生产方法的压力并不大。
结果是，行业需对大学研发的方法进行修改和调整，以符合GMP的要求，并用于临床研究和商业化物料的生产。但实际上，它们从未被开发和发展至适应工业化规模的生产需求。我们现在看到的是更多治疗常见疾病的方法开始进入临床，如阿尔茨海默病和帕金森氏病，其患者数量更多，且每个患者需要更高剂量的AAV颗粒。所以那些实验室方法虽然经过了调整，但真的已经达到了它们的极限，例如，很多项目仍依赖贴壁生长的细胞。
在已上市的产品中，用于AAV载体的标准细胞系是贴壁生长的HEK-293细胞。这些细胞依赖于基质才能增殖，它们可以使用细胞培养板 (例如由10层细胞板堆叠而成的细胞堆栈) 或更复杂的设备来培养，在后者中，细胞生长在纤维上。然而，这些设备在产量和细胞处理方面有其局限性。贴壁生产通常需要使用血清，这是可以接受的，但并不真正满足现代化生物治疗生产的标准。
有一些悬浮方法正在开发中，对于HEK-293细胞，这些工作正在不断演变，但它们的共同点是，生产步骤总是基于使用质粒DNA的瞬时转染，最好是GMP级质量，且需要极大的量，所以你将面对一个重要的成本因素 - 质粒的成本可能高达实际批次生产成本的三分之一。“寻找”质粒还可能成为另一个时间限制，因为它可能需要长达半年的时间。你必须应用一个相对复杂的工艺，包括混合质粒和转染试剂，并将其添加到工艺中。这看起来可能不太复杂，但想象一下，当你在几百升的规模上这样做时，它可能会变得非常复杂，而且还会使这个工艺远不如标准的蛋白质生产工艺那么稳健。所有这些特性意味着即使是悬浮细胞生产也不是真正可规模放大的。
还有其它一些基于生产细胞的辅助病毒感染的方法，但同样，你必须首先生产辅助病毒，你必须在工艺结束时证明产品中没有辅助病毒。尽管存在这些挑战，但使用辅助腺病毒或杆状病毒的方法正在被使用，但它们的应用并不广泛。目前主要的生产方法仍然是质粒转染。
问：在基因治疗生产的不同阶段，病毒载体的生产会带来哪些挑战?你们如何应对这些挑战的？
NF：最大的挑战是在商业化阶段，因为你必须确保供应足够数量的剂量。当你向监管当局提交你的市场申请时，你必须说明你如何保证你的产品供应。
在项目的早期阶段，时间似乎是一个关键因素 - 理想情况下，你会想成为第一个将产品推进到临床的人，你想成为第一个进入市场的人。我们在开发AAV载体的客户身上看到了这一点：他们知道产品应该是什么样子的，他们有令人信服的动物实验数据，现在他们需要cGMP物料，以快速进入I期临床阶段。在这种情况下，构建稳定细胞系所需的时间 - 大约一年 - 可能会被认为太长了。我们正在通过在初始临床阶段返回瞬时生产，以提供快速获得GMP物料的途径，来解决这些限制，这种方式使用我们所称的Alpha细胞系，最终生产细胞的前身。通过这种方式，我们可以在细胞系开发的同时，相对快速地交付临床GMP物料。在下一个临床阶段，我们的客户将获得来自稳定细胞系的物料，后者与用于瞬时生产的细胞系密切相关，从而避免了主要平台的切换。
在开发路径的另一端，我们也听到有大型制药公司在后期遇到障碍 - 他们刚刚获得了一个在初步临床试验中看起来非常有前景的项目的授权，但现在他们发现所使用的生产平台不能在更大的规模条件下很好地工作。当他们考虑III期及以后的生产时，他们意识到使用贴壁培养的HEK-293细胞转染并不是一个可行的选择。这是我们正在与之合作的完全不同的客户类别，我们正在帮助他们过渡到我们的ELEVECTA®平台。
问：纵观整个病毒载体制造领域，您对该领域未来5-10年的预测是什么?
NF:我预测在用于体内基因治疗的AAV领域，我们将看到许多新的血清型，其将具有特定的组织趋向性，以帮助指导治疗药物靶向目标组织。有很多公司在筛选和开发新的AAV血清型。好的一方面是生产技术适用于所有这些血清型; 如果你对血清型1使用瞬时转染，它对血清型2也有效。对于ELEVECTA®来说，也是如此 - 它在我们迄今为止测试的所有不同血清型中一直工作得很好。
我预计主要的挑战将是降低生产成本。基因治疗目前的价格使世界各地的许多患者无法接受。患者数量的增加确实意味着你可以降低产品价格，但如果生产成本太高，就没有办法充分降低价格。因此，我们需要更好、更经济的生产方法。
问：你们也提供腺病毒载体的生产细胞系。您能告诉我们您对利用这些资源生产COVID-19疫苗有什么兴趣吗?
NF：当COVID-19开始成为一个主要的健康威胁时，我们的第一个想法是找到做出贡献的方法，但最初我们一片空白。随后，我们了解到，一些公司正在开发基于非复制腺病毒载体的COVID-19疫苗，在其表面递呈Sars-CoV2抗原。其优点是腺病毒载体本身是无害的，但它能增强免疫反应。
我们的细胞系最初是用来制造腺病毒载体的，它被设计成这样一种形式，即不会意外产生具有复制能力的腺病毒。对于标准的生产细胞系，同样是HEK-293，其基因设置是这样的，意外的同源重组可能发生，导致在1010个颗粒中出现多达100个复制完整的腺病毒。这听起来不是一个很大的数字，但这是一个重大的风险，因为这种具有复制能力的腺病毒可能会在患者体内复制。由于疫苗的安全性至关重要，毕竟疫苗是给健康人群接种的，所以我们收到了研究这类COVID-19疫苗的公司的请求，要求使用我们的平台，以避免产生具有复制能力的腺病毒的风险。
原文：N.Faust, Scaling AAV vector manufacture: overcoming roadblocks to the translation of gene therapies. Cell & Gene Therapy Insights 2020; 6(3), 617–623.
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